Onderzoeksproject Detectie en identificatie van plantenpathogenen met nanopore sequencing
Verkennen van praktische toepassingen voor metabarcoding met MinION ter ondersteuning van het toezicht op gereguleerde plantenpathogenen
Algemeen kader
Het project METAMINSURV onderzoekt de haalbaarheid van het gebruik van MinION metabarcoding bij de detectie en identificatie van enkele plantenpathogenen. Sinds enkele jaren is er in de wereld van metagenomische DNA- en RNAsequenering een versnelling en democratisering gaande. Zo baseert de zeer snelle zogenaamde nanopore sequenering zich op het analyseren van vrij lange strengen van DNA via een heel klein gaatje, een zogenaamde nanoporie. Met die techniek hebben ze in UK een draagbaar DNA sequenceringstoestel (MinION) ontwikkeld dat voor bepaalde (menselijke) ziektes al real-time diagnostische analyses trefzeker kan leveren. Doel van dit project is om het potentieel van MinION te testen aan de hand van twee cases: 1) bacteriën die zich in het weefseltype van de bast van een boom bevinden, meer bepaald Candidatus Phytoplasma- en Candidatus Liberibactersoorten en 2) pathogene schimmels in bossen in complexe gemeenschappen van verschillende oorsprong (zaden van coniferen en sporenvallen). Om dit potentieel echt in kaart te brengen worden er talrijke issues rond het metabarcoding-proces uitgeklaard en op punt gesteld.
Onderzoeksaanpak
Toegepast op beide case studies beantwoordt ILVO volgende specifieke onderzoeksvragen: Welke barcode(s), primer(s) en referentie database(s) combinaties zijn het meest geschikt? Wat is de gevoeligheid en specificiteit van MinION metabarcoding in functie van de detectie en identificatie van de pathogenen van interesse, terwijl er 4 groepen van parameters worden gevarieerd? Die parameters zijn: 1) het type monsters (mock communities, spiked monsters, echte monsters); 2) verschillende protocollen voor bibliotheekvoorbereiding en sequentiedieptes; 3) verschillende (combinaties van multiplexed) barcodes en/of primers en 4) verschillende bio-informatica pijplijnen en/of referentiedatabanken. Wat zijn de voordelen en beperkingen van het gebruik van MinION metabarcoding voor de detectie en identificatie van plantenpathogenen (wat is dus de gevoeligheid, de specificiteit, de snelheid, de kostprijs)? Hoe bruikbaar ten slotte zijn de ontwikkelde protocollen voor andere barcode/organisme combinaties?
Relevantie/Valorisatie
METAMINSURV levert naar verwachting bruikbare labprotocollen en bijhorende bio-informatica pijplijnen, om de genoemde plantenpathogenen (floëembacteriën en fungi) te detecteren en te identificeren via MinION metabarcoding. Doordat er "mock communities", "spike-ins" en echte stalen worden gebruikt in de twee cases, en doordat er wordt vergeleken met analyseresultaten uitgevoerd met alternatieve methodes, krijgen we een eerlijk inzicht in het potentieel van MinION metabarcoding voor de routinediagnostiek van plantenpathogenen. We plannen de onderzoeksresultaten te verspreiden via wetenschappelijke publicaties in peer-reviewed tijdschriften. De ontwikkelde protocollen en bio-informatica pijplijnen delen we met de autoriteiten (NPPO, FOD Volksgezondheid, FAVV en de Vlaamse Overheid) en de wetenschappelijke gemeenschap. Door generieke richtlijnen op te stellen voor de optimalisatie van MinION metabarcoding en bijhorende analyseprotocollen verwachten we dat dit de ontwikkeling voor gelijkaardige protocollen stimuleert voor andere plantenpathogenen, en meer specifiek om meerdere (dicht verwante) pathogenen in één stap te detecteren.
Financiering
FOD Volksgezondheid, Veiligheid van de voedselketen en Leefmilieu
